Voges-Proskaueri testimise alus, valmistamine ja kasutamine



The Voges-Proskaueri test on biokeemiline test, mida kasutatakse Enterobacteriaceae perekonda kuuluvate bakterite tuvastamiseks. Eriti on kasulik eristada Escherichia coli of Klebsiella ja Enterobacter, muu hulgas.

Katse viiakse läbi vedelas söötmes, mida nimetatakse metüülpunaseks Voges Proskaueriks, paremini tuntud akronüümiga RM / VP. See söötmes on puhverdatud polüoon, glükoos, dikaliumfosfaat ja destilleeritud vesi.

Praegune RM / VP söötmeks on Clarki ja Lubsi sööde modifikatsioon, mis sisaldas algselt väiksemat kontsentratsiooni peptoone ja glükoosi. Seetõttu tekkis Voges-Proskaueri positiivse reaktsiooni jaoks vähem vesinikiooni.

Test põhineb mikroorganismi võimel kasutada glükoosi butüleenglükooli kaudu ja moodustada neutraalne lõpptoode, mida nimetatakse atsetoiiniks hapniku ja leeliselise pH juuresolekul..

RM / VP-söötmes võib lisaks Voges-Proskauer testi avastamisele ilmneda ka metüülpunase katse..

Indeks

  • 1 Sihtasutus
    • 1.1 Voges-Proskauer testi alus
    • 1.2 Katse ja tõlgendamise arendamise alused
  • 2 Valmistamine
    • 2.1 Keskmine RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagent
    • 2.3 Voges B reaktiiv
  • 3 Voges-Proskaueri testi protseduur
    • 3.1 Katse väljatöötamine
  • 4 Kasutamine
  • 5 Kvaliteedikontroll
  • 6 Viited

Sihtasutus

Voges-Proskauer testi alus

Söötmes olevad pluripeptonasid tagavad bakterite kasvu seisukohalt olulise toitumisvajaduse. Glükoos on omakorda peamine ühend. Paljud bakterid on võimelised glükoosi metaboliseerima ja moodustama püroviinhapet.

Püroviinhape on glükoosi metabolismi keskpunkt ja sealt võib iga mikroorganism olla erinev. Mõned moodustavad happeid, nagu piimhape, äädikhape, sipelghape ja merevaikhape, ja teised moodustavad neutraalseid tooteid, nagu 2,3-butaandiool.

Voges-Proskauer test näitab mikroorganismi võimet moodustada atsetüülmetüülkarbinooli (atsetoiin), 2,3-butaandiooli vaheprodukti aeroobsetes tingimustes.

Atsetiin redutseeritakse ja moodustab 2,3-butaandiooli, kuid see reaktsioon on pöörduv, nii et 2,3-butaandiooli oksüdeerimisel moodustub atsetoiin. Seetõttu on oluline hapnik.

Dikaliumfosfaat on puhver, mis niisutab segu pH tasemel 6,9 ± 0,2..

Katse ja tõlgendamise arendamise alused

Reaktsiooni demonstreerimiseks tuleb läbi viia kaks reaktiivi (Barriti reaktiivid), mida tuntakse kui Voges A ja Voges B..

Voges A on a-naftooli 5% lahus ja Voges B on 40% kaaliumhüdroksiidi preparaat. Kui kaaliumhüdroksiidi ei ole, võib selle asendada 40% naatriumhüdroksiidiga.

Α-naftol on katalüsaator, mis suurendab reaktsiooni värvi intensiivsust, mis muudab testi tundlikumaks. Kõigepealt tuleb a-naftol lisada, segades toru nii, et sööde puutuks kokku hapnikuga. Sel viisil oksüdeeritakse olemasolev atsetoiin diatsetüülrühmaks ja 2,3-butaandiool oksüdeeritakse atsetoiini saamiseks, viies selle diatsetüülrühma..

Nii seondub a-naftool diatsetüüliga, mis omakorda on seotud arginiini aminohappe kohal oleva guanidiinituumaga, viimane on pluripeptoonist pärit..

CO. Absorbeerimise eest vastutab kaalium- või naatriumhüdroksiid2 ja reageerida peptiididega. See reaktsioon põhjustab roosa-lõhe värvi tekke, mis on selgelt nähtav pärast toru väga hästi raputamist.

Värvuse koheseks tekkimiseks tuleb segada õige kogus diasetüül-, peptooni- ja a-naftooli. Kui see ei juhtu, laske torul enne tõlkimist 15 minutit puhata.

Tavaliselt on test 2 kuni 5 minuti pärast positiivne, kui on näha nõrk roosa värv. Kui jäetakse 30 minuti kuni 1 tunni jooksul puhkama, on värvi intensiivsus maksimaalne (sügavpunane).

Negatiivne test ilmneb, kui puljong on kollane. 1 tunni pärast, kui katse on negatiivne, võib kaaliumhüdroksiidi ja a-naftooli reaktsiooni tulemusel moodustada vase värvi..

Ettevalmistus

Keskmise RM / VP

Kaalutakse 17 g veetustatud söödet ja lahustatakse ühe liitri destilleeritud vees. Laske seista 5 minutit. Täielikuks lahustumiseks kuumutage keemistemperatuurini. Serveeri 3–4 ml tuubides ja steriliseerida autoklaavis 121 ° C juures 15 minutit.

Dehüdreeritud kultuurikeskkond on beež ja valmistatud keskkond on helge merevaik.

Söötme lõplik pH on 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagent

Kaalutakse 5 g a-naftooli ja lahustatakse 50 ml etüülalkoholis (absoluutne). Seejärel jätkatakse etüülalkoholi lisamist kuni 100 ml-ni.

Reagent Voges B

Kaalutakse 40 g kaaliumhüdroksiidi ja lahustatakse keeduklaasis 50 ml destilleeritud vees. Klaas tuleb temperatuuri reguleerimiseks asetada külma veevannini, sest valmistise lahustamise ajal tõuseb see järsult.

Pärast lahuse külmumist kantakse see gradueeritud balloonile ja viiakse destilleeritud veega 100 ml-ni.

Voges-Proskaueri testi menetlus

Voges-Proskaueri testi läbiviimiseks inokuleeritakse RM / VP-puljong uuritava mikroorganismiga, puhtast kultuurist 18 kuni 24 tundi.

Inokulaat ei tohiks olla liiga tihe. Seda inkubeeritakse 35-37 ° C juures 24 kuni 48 tundi, kuigi mõnikord on inkubeerimine vajalik mitu päeva. Cowan ja Steel usuvad, et 5 päeva on minimaalne inkubatsiooniaeg, mis on vajalik kõikide positiivsete Voges-Proskauer (VP) liikide avastamiseks Enterobacteriaceae perekonnas.

Katse väljatöötamine

Eraldage 1 ml alikvoot katseklaasis ja viige see läbi järgmiselt: asetage 12 tilka (0,6 ml) Voges A reaktiivi ja 4 tilka (0,2 ml) Voges B. Segage, et õhutada ja lasta seista. 5–10 minutit enne selle sooritamist. Kui test on siiski negatiivne, laske sellel seista ja jälgida toru 30 minuti kuni 1 tunni pärast.

Roosa-punase värvi välimus näitab, et Voges-Proskaueri reaktsioon on positiivne. Kui sööde jääb kollaseks, on reaktsioon negatiivne.

Arendajate lisamine näidatud järjekorras ja koguses on vale negatiivsete vältimiseks hädavajalik.

Kasutage

Voges-Proskaueri test on kasulik, et eristada E. coli negatiivsed, muuhulgas perekondadest Klebsiella, Enterobacter, Serratia, mis on VP positiivsed.

Kvaliteedikontroll

Valmistatud söötme kvaliteedi kontrollimiseks võib kasutada kontrolltüvesid. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium ja Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Oodatavad tulemused on ainult positiivsed Voges-Proskauer'i reaktsioonid K. pneumoniae ja E. cloacae. Ülejäänud annavad negatiivseid reaktsioone.

Viited

  1. Laboratooriumid Britania. MR-VP keskmine. 2015. Saadaval aadressil: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Saadaval: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokeemilised testid kliinilise tähtsusega bakterite identifitseerimiseks. 3. ed. Toimetus Panamericana. Buenos Aires Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scott'i mikrobioloogiline diagnoos. 12 ed. Toimetus Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobioloogiline diagnoos. 5. ed. Toimetus Panamericana S.A. Argentina.