DNA järjestus Maxam-Gilbert, Sanger meetod, näited



The DNA sekveneerimine (deoksüribonukleiinhape) on molekulaarbioloogia laborites läbiviidav protseduur, mis võimaldab teada huvipakkuva geneetilise materjali nukleotiidide järjekorda. Lisaks võib ilmneda ka RNA (ribonukleiinhappe) sekveneerimine.

See meetod on bioloogiliste teaduste arendamiseks hädavajalik. See kehtib ka teiste teadmiste valdkondade kohta, näiteks meditsiiniline diagnoosimine ja kohtuekspertiisi uurimine.

Varem peeti DNA ahela sekveneerimist aeglaseks ja kulukaks aktiivsuseks, mis võimaldas identifitseerida vaid mõned aluspaarid oligonukleotiidides..

Tänapäeval on kõikides teaduse edusammudes DNA sekveneerimine tavapärane toiming paljudes laborites kogu maailmas tänu sellele, et selle valdkonna uuringud on peaaegu 50 aastat. Keti pikkuse kohta saate väga lühikese aja jooksul järjestada kuni miljoneid baaspaare.

Selleks on välja töötatud kümneid tehnikaid, mis erinevad hinna ja täpsuse poolest. Käesolevas artiklis kirjeldame nii klassikalisi kui ka kaasaegseid tehnikaid, millest igaühel on oma eelised ja puudused.

Seni võimaldavad sekveneerimismeetodid saada täielike genoomide järjestuse väikestest prokarüootidest ja pärmidest inimese genoomi..

Indeks

  • 1 DNA struktuur
  • 2 Ajalugu
  • 3 Sanger-meetod
    • 3.1 Reaktsiooni põhikomponendid
    • 3.2 Tulemuste lugemine
  • 4 Automaatne järjestamine
  • 5 Maxam-Gilberti järjestamine
    • 5.1 Menetlus
    • 5.2 Tulemuste lugemine
  • 6 Massiivne järjestamine
    • 6.1
    • 6.2 Sekveneerimine sünteesi teel
    • 6.3 Sekveneerimine ligeerimise teel
    • 6.4 Ion Torrenti järjestamine
  • 7 Näited
    • 7.1 Inimese genoomi sekveneerimine
  • 8 Tähtsus ja rakendused
  • 9 Viited

DNA struktuur

Selleks, et mõista DNA sekveneerimiseks kasutatavaid meetodeid ja meetodeid, on vaja teada molekuli struktuuri ja koostise teatud põhiaspekte.

DNA on biomolekul, mis leidub kõigis elusolendites, alates bakteritest kuni suurte veeloomadeni. Organellidel - nagu mitokondrid ja kloroplastid - on nende sees ringikujuline DNA molekul. Isegi mõnedes viirustes on leitud geneetiline materjal DNA.

Struktuuriliselt on DNA nukleotiidide kogum. Igaüks neist on integreeritud süsivesiku, lämmastiku aluse (A, T, C või G) ja fosfaatrühmaga. DNA sekveneerimise eesmärk on paljastada järjestus, milles neli lämmastiku alust on järjestuses.

Ajalugu

1950. aastate keskel kirjeldasid teadlased Watson ja Crick DNA struktuuri, kasutades kristoloogilisi tehnikaid. Kuid ükski neist teadlastest ei suutnud leida võimalust järjestuse avastamiseks.

Kuigi esinesid teatud eelkäijad, oli kõige olulisem sündmus Sangeri meetodi loomine 1977. aastal. Meetodi isa Frederick Sanger oli Briti biokeemik, kahe Nobeli auhinna võitja oma tohutu panuse eest bioloogiateadustesse.

See tehnika on kirjanduses tuntud ka kui "ahela terminatsioon" või dideoksünukleotiidid. Järgnevalt kirjeldame selle tehnika põhimõtteid ja neid, mis töötati välja selle parendamise ja innovatsiooni alusel.

Sangeri meetod

Sangeri meetodi väljatöötamine kujutas endast molekulaarbioloogia olulist sündmust. See hõlmab DNA replikatsiooniprotsessi põhikomponente, mis tavaliselt rakus esinevad, kuid lisades spetsiaalse komponendi: dideoksünukleotiidid.

Reaktsiooni peamised komponendid

- DNA polümeraas: ensüüm DNA polümeraas on protsessi oluline element. See molekul osaleb DNA ahela replikatsioonis ja selle roll on uue ahela süntees, mis sobib deoksüribonukleotiidtrifosfaadiga komplementaarsete ainetega..

Pidage meeles, et DNA-s seostatakse tümiinid (T) adeniinidega (A) kahe vesiniksideme abil, samas kui tsütosiin (C) on guaniiniga (G) kolmel sillal.

- Nukleotiidid: Sanger-järjestus hõlmab kahte tüüpi nukleotiide, nelja 2'-deoksünukleotiidi (lühendatult dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) ja nelja dideoksünukleotiidi (ddATP, ddGTP, ddCTP ja ddTTP)..

Kuigi dideoksünukleotiidid on sarnased monomeeridega, mis on tavaliselt DNA-sse inkorporeeritud, puudub nende struktuuril -OH rühm. See muudab uue nukleotiidi ahelale lisamise võimatuks.

Seega, kui lisatakse spetsiaalne nukleotiid - täiesti juhuslikul viisil - moodustumise ahelasse, on süntees halvatud. Sel viisil on reaktsiooni lõpus erineva suurusega ahelad, millest igaüks peatas reaktsiooni teises punktis.

Eksperimentaalselt valmistatakse ette neli katset. Igaüks sisaldab DNA-d, mis on ekstraheeritud huvipakkuvast bioloogilisest proovist, normaalsetest nukleotiididest ja ühest neljast erilisest nukleotiidist. Või on spetsiaalsed nukleotiidid tähistatud teatud tüüpi fluorestseeruva markeriga (vt allpool automatiseeritud järjestust).

Tulemuste lugemine

Esimene samm on eraldada kõik sünteesitud ahelad vastavalt nende suurusele. Mõned on pikemad kui teised, sõltuvalt sellest, kus spetsiaalsed alused olid ühendatud.

On erinevaid biokeemilisi meetodeid, mis võimaldavad eraldada segu komponente, kasutades suurust kui diskrimineerivat omadust. Sangeri meetodis eraldatakse erinevad ahelad elektroforeesiga. Tehnoloogia kõige keerulisemates variantides kasutatakse kapillaarelektroforeesi.

Seega liiguvad pikemad ahelad vähem kui lühemad variandid. Seejärel läbib see süsteem lugeja, mis tunneb ära igas dideoksünukleotiidis sisalduva markeri. Sel viisil saab teada järjestuse järjekorda.

See "esimese põlvkonna" tehnika on võimeline lugema DNA fragmente, mis ei ole suuremad kui 1 kilobase. Praegu kasutatakse Sangeri meetodit mitmetes laborites, tavaliselt oma kaasaegsetes variantides. Lisaks kasutatakse seda kõige keerulisemate tehnikatega, kuid vähem täpsete tulemustega.

Automaatne järjestamine

Kui on vaja ulatuslikku sekveneerimist, kiirendatakse protsessi automatiseerimisega. See on Sangeri ahela lõpetamise meetodi variatsioon, kus praimerid on tähistatud fluorestseeruvate toodetega, et neid eristada.

Seejärel viiakse reaktsiooni saadus läbi elektroforeesil - kõik ühes reas. Kui iga fragment lahkub geeli lõplikust osast, tuvastatakse see kiiresti fluorestsentsmärgisega, mille viga ümbritseb 1%.

Kõige keerukamates süsteemides on kuni 96 kapillaaritoru, mida haldab robot, mis on ühendatud robotiga. See tähendab, et samaaegselt saab hinnata 96 DNA proovi. Seega on protsess, mis hõlmab elektroforeesi ja tulemuste analüüsi, täielikult automatiseeritud.

Ühel päeval võivad need süsteemid järjestada kuni 550 000 alust. Protsessi ajal on inimtegevus tarbetu, meetodi käivitamiseks kulub vaid 15 minutit.

Maxam-Gilberti järjestamine

Samal ajal, kui Sanger avaldas oma töö, suutis kaks uurijat nimega Allan Maxan ja Walter Gilbert välja töötada teise meetodi DNA järjestuse saamiseks. Meetod sai sel ajal populaarsust, kuid hiljem asendati Sangeri meetodi täiustamisega.

Vastupidiselt Sangeri meetodile ei hõlma Maxani ja Gilberti sekveneerimine (või keemiline sekveneerimine, nagu ka teada) hübridisatsioonireaktsioone. Metoodika koosneb märgistamisest reaktiivsete ainetega ühes otsas, millele järgneb puhastamisprotsess.

Selle meetodi üks negatiivseid aspekte on selle tohutu keerukus ja kasutajale ohtlike kemikaalide kasutamine. Keemilised lagunemised indutseeritakse DMS, sipelghappe, hüdrasiini ja hüdrasiini kasutamisega sooladega.

Menetlus

Protokoll algab märgise andmisega kihi 5'-otsas fosformärgisega 32, seejärel toimub lämmastiku aluse keemiline modifitseerimine ja see eraldatakse. Lõpuks tekib abasiivse piirkonna lõhenemine.

Kõigepealt lühendatakse järjestatav ahel väiksemateks segmentideks. See etapp viiakse läbi restriktsiooniensüümidega, mille tulemuseks on silmapaistvad äärmused.

Seejärel viiakse reaktsioon läbi leeliselise fosfataasiga, mille eesmärgiks on fosfaatrühma eemaldamine. Seega võib märgistuse läbiviimiseks kasutada polünukleotiidi kinaasi.

Kett on denatureeritud (kaks ahelat on avatud). Siis jätkame kemikaalide rakendamist. Need lõhustamisreaktsioonid viiakse läbi kontrollitud viisil ja milliseid sidemeid katkeb iga kasutatav kemikaal.

Tulemuste lugemine

Nagu Sangeri meetodis, hõlmab tulemuste lugemine elektroforeesi süsteemis saadud ahelate suuruse eraldamist. Polüakrüülamiidist koosnevad süsteemid võimaldavad saada geeli lugemiseks väga sobivat resolutsiooni.

Massiline järjestamine

Massiivne järjestamine hõlmab mitmeid uusi meetodeid, lühendatult NGS, inglise keelest.Järgmise põlvkonna järjestamine ".

NGS-iga kataloogitud meetodid nõuavad DNA amplifikatsiooni varasemat etappi (nad ei tööta ühe molekuliga). Lisaks on kasutatavad platvormid väga erinevad. Järgnevalt kirjeldatakse kõige populaarsemate meetodite põhimõtteid:

Pürosekventsimine

See hõlmab pürofosfaadi vabanemise jälgimist, mis tekib iga kord, kui DNA ahelale lisatakse uus nukleotiid. Ensüümsüsteem on ühendatud, nii et valgusemissioon (mis on kaameraga tuvastatav) toimub iga kord, kui uus nukleotiid on sisse lülitatud.

Protsess algab iga lämmastiku baasi eraldi inkubeerimisega, et kontrollida, kas on olemas valguskiirgus. Püroskefineerimine võib teostada pikkade ahelate lugemist, kuid leitud veamäär on kõrge.

Sekveneerimine sünteesi teel

See hõlmab märgistatud nukleotiidide lisamist. Need fluorestseeruvad komponendid lisatakse, pestakse ja lisatud nukleotiid täheldatakse. Seejärel kõrvaldatakse nukleotiidi märgistamine ja ahela süntees võib jätkuda. Järgmises etapis lisatakse samuti märgistatud nukleotiid ja nimetatud etappe korratakse.

Selle meetodi üks puudus tekib siis, kui fluorestseeruvad markerid ei ole täielikult kõrvaldatud. Need heitkogused tekitavad taustavigu, mis põhjustab olulisi vigu.

Sekveneerimine ligeerimise teel

See meetod erineb teistest, kuna see ei kasuta DNA polümeraasi. Selle asemel on selle meetodi võtmeensüümiks ligaas. Kasutatakse siin fluorestsentselt märgistatud DNA fragmente, mis on seotud ensüümiga ja tuvastatakse.

Selle tehnikaga on suurim probleem töötlemisvõimelise fragmenti väga lühike pikkus.

Ionjärjestuste Torrent

See meetod põhineb H-i mõõtmisel+ mis vabastatakse iga kord, kui lisatakse uus nukleotiid. Põhimõte on üsna sarnane püroseerumisega, kuid palju odavam.

Näited

Inimese genoomi sekveneerimine

Inimese genoomi järjestamine on olnud bioloogia üks kõige paljutõotavamaid väljakutseid, samuti on see üks tuntumaid konkurente teaduse ajaloos. Tegelikult sai projektis osalevate teadlaste jaoks genoomide sekveneerimine konkurentsiks.

1990. aastal alustas ta nn inimese genoomi projekti, mida juhtis kuulus teadlane, Nobeli preemia võitja James Watson. Ühe aasta pärast, 1991. aastal, võtab Venter välja Watsoni "peksmise" ja tema ees seisva genoomi sekkumise. Kuid 1992. aastal jäi Watson pensionile ja käsu tegi teine ​​teadlane.

1995. aastal teatas Venter oma edukusest bakteri genoomi täielikul sekveneerimisel juhusliku sekveneerimise meetodil. Samamoodi teatas vastupidine meeskond aasta hiljem pärmi genoomi järjestuse.

2000. aastal lõpetati võistlus. Mõlemad ettevõtted avaldasid oma esialgse tulemuse kogu genoomist kahes kõige prestiižilisemas ajakirjas teaduses: Loodus ja Teadus.

Kuid teadlased jätkasid tööd ettepanekute parandamiseks ning 2006. aastal lõpetati järjestused teatud inimese kromosoomidega.

Tähtsus ja rakendused

Bioloogide ja nendega seotud spetsialistide jaoks on väärtusliku molekuli nukleotiidide tähtsus sama oluline kui DNA. See polünukleotiidide ahel sisaldab kogu informatsiooni, mis on vajalik kõigi eluvormide väljatöötamiseks ja säilitamiseks.

Nendel põhjustel on selle jada tundmine bioloogiliste uuringute jaoks oluline. Põhimõtteliselt võimaldab sekveneerimine mõõta bioloogiliste süsteemide ühte kõige olulisemat omadust ja määrata nende vahel erinevusi.

Järjestust kasutatakse laialdaselt taksonoomide ja süstematistide poolt, kuna teatud DNA järjestused võimaldavad kehtestada kriteeriumid, et teha kindlaks, kas kaks organismi kuuluvad samasse liiki või mitte, samuti on võimalik pakkuda välja hüpoteese nende filogeneetiliste suhete kohta..

Lisaks on DNA sekveneerimisel rakendusi meditsiini ja diagnostika valdkonnas. Näiteks on olemas taskukohased ja kättesaadavad süsteemid, mis võimaldavad sekveneerimisel hinnata teatud haiguste (nagu vähk) arendamise tendentsi, kasutades nn lihtsaid nukleotiidi polümorfisme (SNP)..

Kriminalistliku ja kohtuekspertiisi tüübi uurimist on rikastatud ka järjestamise meetoditega ning neid saab kasutada usaldusväärse tõendusmaterjalina teatud isiku osalemisele kuriteos..

Viited

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Järjestuste järjestus: DNA sekveneerimise ajalugu. Genoomika, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K. M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. Järgmise põlvkonna sekveneerimise revolutsioon ja selle mõju genoomikale. Cell, 155(1), 27-38.
  3. Levy, J. (2010). Teaduslikud võistlused. Galileost kuni inimese genoomi projekti. Paraninfo toimetamine.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA sekveneerimine ahelaterminaalsete inhibiitoritega. Riikliku teaduste akadeemia, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Järgmise põlvkonna sekveneerimine muudab tänase bioloogia. Loodusmeetodid, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (toim.). (2014). Järgmise põlvkonna järjestamine. Caister Academic Press.