Proteinaasi K omadused, ensümaatiline aktiivsus ja rakendused



The proteinaas K on ensüüm, mis kuulub seriinproteaaside rühma, see tähendab, et selle aktiivne katalüütiline keskus on aminohappe seriin ja selle funktsioon on peptiidsidemete katkestamine hüdrolüüsi teel. See ensüüm omakorda kuulub valkude subtilisiinide (peptidaas S8) perekonda..

Proteinaas K molekulmass (MW) on 28 900 daltonit ja see eraldati esimest korda 1974. aastal seenekstraktidest. Engyodontiumi album, varem tuntud nimega Tritirachium album Limber.

Sellel on kõrge proteolüütiline võime, mis on näidanud, et on võimeline hajutama juustes leiduvat keratiini. Ingliskeelne sõna keratiin on kirjutatud "keratiiniks", mistõttu seda nimetatakse "proteinaasiks K".

Tänu oma võimele lõhustada natiivseid valke, on see ensüüm kasulik mitmesuguste molekulaarbioloogiliste meetodite puhul. Seda kasutatakse peamiselt kõrge molekulmassiga (MW) nukleiinhapete eraldamiseks ja valmistamiseks..

Proteinaas K toimib, vabastades tuuma DNA, hävitades valgud ja inaktiveerides RNaasid ja DNaasid, st kõrvaldab DNA ja RNA preparaatides nukleotiidid..

Teisest küljest on näha, et proteinaas K võib hüdrolüüsida mõningaid denatureeritud natiivseid valke, mis on tekitanud teadlaste huvi selle kasutamiseks prioonvalkude (PrPC) uurimisel..

Siiski, hoolimata suurest proteolüütilisest potentsiaalist, on valke, mis on resistentsed proteinaasi K toime suhtes..

Indeks

  • 1 Proteinaasi K omadused
  • 2 Ensümaatiline aktiivsus
  • 3 Rakendused
  • 4 Proteinaasi K eelised
  • 5 Proteinaasiresistentsed valgud K
  • 6 Viited

Proteinaasi K omadused

Proteinaas K-l on kolmest kihist moodustunud tertsiaarne struktuur, milles on seitsmest ahelast koosnev β-leht kahe spiraalikihi vahel. Kuna see kuulub S8 peptidaaside perekonda, on sellele iseloomulik, et selle aktiivses kohas on katalüütiline triaad, mille järjestikune järjestus on (Asp, His ja Ser), mis eristab neid teistest peptidaaside perekondadest..

Seda seriini proteaaside rühmast pärinevat ensüümi iseloomustab peptiidsidemete hüdrolüüsimine alifaatsete ja aromaatsete aminohapete karboksüülrühma lähedal..

Teisest küljest on see võimeline toimima teatud söövitavate ainete, nagu naatriumdodetsüülsulfaat (SDS), Tris-HCL ja EDTA juuresolekul, mida kasutatakse proteiinide denatureerimise soodustamiseks, põhjustades nende natiivse struktuuri kaotamise..

See on esialgne samm valkude valmistamiseks elektroforeesi tehnikaks. PH vahemik, kus proteinaas K toimib üsna lai (2,0 kuni 12,0), optimaalse pH vahemikus 7,5 kuni 12,0 ja selle isoelektriline punkt on 8,9. Nagu võib täheldada, on see aktiivne väga laia pH vahemiku suhtes.

Teine omadus, mis erineb proteinaasist K, on ​​selle stabiilsus kõrgetel temperatuuridel (50–60 ° C)..

Ensümaatiline aktiivsus

Proteinaas K vajab kaltsiumiooni olemasolu, kuigi see ei mõjuta selle aktiivsust, kui on oluline säilitada selle stabiilsus.

Selleks, et proteinaas K teostaks substraadi täielikku lagundamist, on vajalik ligikaudne kokkupuuteaeg 5 minutit kuni 2 tundi..

Kuid selles mõttes Daza et al. Võrreldes mitmel korral valguga K kokkupuute ajal saadud DNA puhtusega ja järeldas, et pikaajaline inkubatsioon (kuni 24 h) parandab oluliselt DNA kvaliteeti..

Nüüd, erinevalt proteiini K-ensüümi erinevates protokollides kasutatud kontsentratsioonist, võib öelda, et see on väga mitmekesine.

Seda võib kasutada väga väikestest kontsentratsioonidest (5 μg / ml) kuni kontsentratsioonini 500 μg / ml. Kuid kõige sagedasemad kontsentratsioonid on vahemikus 50-100 μg / ml, eriti valgu seedimise ja nukleaasi inaktiveerimise puhul. Kuigi koe raviks on vajalik kontsentratsioon 2 mg / ml.

Rakendused

Selle rakendused on väga laiaulatuslikud ja neid võib kokku võtta järgmiselt:

-Seda kasutatakse valgu lagundamisel ja DNA ekstraheerimisel mitmete meetoditega, nagu näiteks soolamine, PK-SDS, tsetüül-trimetüülammooniumbromiid (CTAB), modifitseeritud kaaliumatsetaat ja ekstraheerimine naatriumjodiidiga..

-Nukleaaside inaktiveerimine (RNaasid ja DNaasid).

-Hübridisatsioonitehnikas in situ (HIS), et aidata vabastada nukleiinhape lisaks soovimatute valkude kõrvaldamisele.

-Valgu modifitseerimine.

-Teadusuuringute tasandil, erinevates uuringutes.

Proteinaasi K eelised

Proteinaasi K kasutavate DNA ekstraheerimismeetodite seas on läbi viidud mitmeid võrdlevaid uuringuid, teised aga, kes seda ei kasuta, ja kõik järeldavad, et ensüümi kasutamisel on suurem kasu. Eeliste hulgas võib mainida järgmist:

-Saadakse kõrge kvaliteediga ja puhtusega kõrge molekulmassiga DNA.

-Ekstraheeritud DNA on stabiilne kuni 3 kuud.

Ekstraheeritud DNA-d võib kasutada järgmistes meetodites: Southern blot, polümeraasi ahelreaktsioon (PCR), elektroforees, muu hulgas.

Proteiin K suhtes resistentsed valgud

Erinevad uuringud on leidnud, et prioonid (ebanormaalsed PrPSc toksilised valgud) eristuvad PrPC valkudest (natiivsed), sest nad on resistentsed proteinaasi K toime suhtes, samas kui PrPC on nende toime suhtes tundlikud.

Teised autorid on kirjeldanud, et PrPSc struktuuris on tundlikke osi ja teisi proteinaasi K suhtes resistentseid osi. Kuid mõlemad osad on võrdselt toksilised ja nakkuslikud..

Teisest küljest eraldasid Bastian ja kaastöötajad 1987. aastal 4 valku 28, 30, 66 ja 76 kda \ t Spiroplasma mirum. Kõik olid resistentsed proteinaasi K toimele ja neil oli ka ristreaktsioon mõne priooniga.

On teada, et see liik võib põhjustada katarakti ja olulisi neuroloogilisi kahjustusi ning Bastiani teaduslike leidude tõttu on teiste uuringute käigus püütud seostada see mikroorganism transmissiivsete spongioossete entsefalopaatiatega..

Selle degeneratiivse neuroloogilise patoloogia etioloogia omistatakse tänapäeval siiski prioonidele.

Selles mõttes identifitseerisid Butler ja kaastöötajad 1991. Mycoplasma hyorhinis. See patogeen mõjutab sigu, nakatades nende kudesid, kuid sellisel juhul ei esinenud ristreaktsioone testitud prioonidega.

Paljude teadmatute selgitamiseks on vaja rohkem uuringuid.

Viited

  1. Bastian F, Jennings R ja Gardner W. 1987. Spiroplasma mirum fibrilli valgud. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, kuningas J, Ruiz V. DNA ekstraheerimis- ja puhastamismeetodi hindamine lihaste koest, mis on fikseeritud formaldehüüdis identifitseerimata kaadritest.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E ja Mcgarrity G. Proteinaasi K-resistentsete valkude identifitseerimine ja iseloomustamine klassi Mollicute liikmetes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. DNA protokollide kahe protokolli võrdlus Trypanosoma cruzi kasvatatakse aksiaalses keskkonnas. Peruu. Med. Exp. Rahvatervis  2014; 31 (2): 222-227. Saadaval aadressil: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ja Palma W. Parafiinmaterjalist saadud viie DNA ekstraheerimisprotokolli efektiivsuse määramine molekulaarsete uuringute jaoks. Rev Méd Univ Costa Rica. 2007; 1 (1): 10-19.