DNA mikrokiibid selles, mida see koosneb, protseduur ja rakendused



A DNA mikrokiip, Seda nimetatakse ka DNA kiibiks või DNA mikrokiibiks, see koosneb järjestikku DNA fragmentidest, mis on ankurdatud muutuva materjali füüsilisele toele, kas plastist või klaasist. Iga DNA osa esindab spetsiifilise geeniga komplementaarset järjestust.

Mikroahelate peamine eesmärk on teatud huvitavate geenide ekspressiooni võrdlev uuring. Näiteks on tavaline, et seda tehnikat rakendatakse kahele proovile - ühele tervislikes tingimustes ja ühele patoloogilisele -, et teha kindlaks, milliseid geene ekspresseeritakse ja mis ei ole näidises, mis seisneb seisundis. Nimetatud proov võib olla rakk või koe.

Üldiselt saab geenide ekspressiooni tuvastada ja kvantifitseerida tänu fluorestseeruvate molekulide kasutamisele. Kiipide manipuleerimist teostab enamasti robot ja samaaegselt saab analüüsida suurt hulka geene.

See uuenduslik tehnoloogia on kasulik mitmetele erialadele, alates meditsiinilisest diagnostikast kuni erinevate molekulaarbioloogia uuringuteni proteoomika ja genoomika valdkonnas..

Indeks

  • 1 Mis see koosneb??
    • 1.1 Mikrokiire tüübid
  • 2 Menetlus
    • 2.1 RNA isoleerimine
    • 2.2 cDNA tootmine ja märgistamine
    • 2.3 Hübridisatsioon
    • 2.4 Süsteemi lugemine
  • 3 Rakendused
    • 3.1 Vähk
    • 3.2 Muud haigused
  • 4 Viited

Mis see koosneb??

DNA mikrokiibid (deoksüribonukleiinhape) on kindla maatriksi külge kinnitatud spetsiifiliste DNA segmentide kogum. Need järjestused täiendavad geene, mida soovitakse uurida ja võib esineda kuni 10 000 geeni cm kohta2.

Need omadused võimaldavad organismi geeniekspressiooni süstemaatilist ja massiivset uurimist.

Teave, mida raku vajab selle toimimiseks, on kodeeritud "geenideks". Teatud geenid sisaldavad juhiseid oluliste bioloogiliste molekulide loomiseks, mida nimetatakse valkudeks.

Geen ekspresseeritakse, kui selle DNA transkribeeritakse messenger RNA vahendaja molekuliks ja geeni ekspressioon võib varieeruda sõltuvalt selle DNA segmendi transkriptsiooni tasemest. Teatud juhtudel võib ekspressiooni muutus osutuda haigusteks.

Hübridisatsiooni põhimõte muudab võimalikuks mikrokiibi toimimise. DNA on molekul, mis koosneb neljast nukleotiiditüübist: adeniinist, tümiinist, guaniinist ja tsütosiinist.

Kahekordse spiraalse struktuuri moodustamiseks on adeniin grupeeritud tümiini ja tsütosiiniga guaniiniga. Seega võib kaks komplementaarset ahelat siduda vesiniksidemetega.

Microarrae tüübid

Mikrolülituste struktuuri osas on kaks varianti: komplementaarse DNA või oligonukleotiidide personaliseeritud ühendid ja kaubanduslike äriühingute poolt toodetud kaubanduslikud suure tihedusega mikrokiired nagu Affymetrix GeneChip.

Esimene microarray tüüp võimaldab analüüsida RNA-d kahest erinevast proovist ühel kiibil, samas kui teine ​​variatsioon on kaubanduslikku tüüpi ja omab suurt hulka geene (näiteks Affymetrix GeneChipil on umbes 12 000 inimese geeni), mis võimaldab analüüsida üks proov.

Menetlus

RNA isoleerimine

Esimeseks sammuks katse läbiviimisel, kasutades mikrokiibi tehnoloogiat, on RNA molekulide eraldamine ja puhastamine (võib olla RNS või muu RNA tüüp).

Kui soovite võrrelda kahte proovi (tervislik ja haige, kontroll ja ravi), tuleks teha molekuli eraldamine mõlemas koes..

CDNA tootmine ja märgistamine

Seejärel allutatakse RNA pöördtranskriptsiooni protsessile märgistatud nukleotiidide juuresolekul ja seega saadakse komplementaarne DNA või cDNA..

Märgistus võib olla fluorestseeruv ja kahe analüüsitava koe vahel diferentseeruv. Fluorestsentsühendeid Cy3 ja Cy5 kasutatakse traditsiooniliselt, kuna nad eraldavad fluorestsentsi erinevatel lainepikkustel. Cy3 puhul on see punast värvi ja Cy5 vastab oranži ja kollase vahelise spektrile.

Hübridisatsioon

CDNA-sid segatakse ja inkubeeritakse DNA mikrokihis, et võimaldada mõlemast proovist cDNA hübridisatsioon (s.o seondumine), kui DNA osa on immobiliseeritud mikrokihi tahkele pinnale..

Suuremat protsenti hübridisatsioonist sondiga mikrokiibis tõlgendatakse vastava mRNA suurema koe ekspressioonina.

Süsteemi lugemine

Ekspressiooni kvantifitseerimine toimub, kaasates lugejasüsteemi, mis määrab iga cDNA poolt emiteeritud fluorestsentsi koguse värvikoodi. Näiteks kui punast kasutatakse patoloogilise seisundi tähistamiseks ja see hübridiseerub suuremas osas, on punane komponent domineeriv.

Selle süsteemiga on võimalik teada iga geeni üleekspressiooni või represseerimist mõlemas valitud seisundis. Teisisõnu, saate teada katse käigus hinnatud proovide transkriptoomi.

Rakendused

Praegu peetakse mikrokiire väga võimekaks meditsiini valdkonnas. See uus tehnoloogia võimaldab diagnoosida haigusi ja paremini mõista, kuidas geeniekspressiooni erinevates meditsiinilistes tingimustes modifitseeritakse.

Lisaks võimaldab see võrrelda kontrollkoe ja teatud ravimiga töödeldud koe, et uurida võimaliku ravitoime mõju..

Selleks võrreldakse normaalset seisundit ja haigusseisundit enne ja pärast ravimi manustamist. Uurides ravimi toimet genoomi in vivo teil on selle toimemehhanismist parem ülevaade. Lisaks võib mõista, miks mõned konkreetsed ravimid põhjustavad soovimatuid kõrvaltoimeid.

Vähk

Vähk tabab DNA mikroarkade abil uuritud haiguste nimekirju. Seda metosoloogiat on kasutatud haiguse klassifitseerimiseks ja prognoosimiseks, eriti leukeemia korral.

Selle seisundi uurimise valdkond hõlmab vähirakkude molekulaarsete aluste kokkusurumist ja iseloomustamist, et leida geeniekspressiooni mustrid, mis põhjustavad rakutsükli reguleerimises ja rakusurma (või apoptoosi) protsessides ebaõnnestumisi..

Muud haigused

Mikrolülituste kasutamisega oleme suutnud selgitada geenide diferentsiaalse ekspressiooni profiile allergia, primaarse immuunpuudulikkuse, autoimmuunhaiguste (nt reumatoidartriit) ja nakkushaiguste korral..

Viited

  1. Bednar, M. (2000). DNA microarray tehnoloogia ja rakendus. Medical Science Monitor, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S. R. (2001). Komplekssete bioloogiliste protsesside DNA mikroskeemide analüüs. Ameerika nefroloogiaühingu ajakiri, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D.V., Bulak Arpat, A., Wang, N. & Carroll, R.J. (2002). DNA mikrokiibi katsed: bioloogilised ja tehnoloogilised aspektid. Biomeetria, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA mikroarvad ja nende rakendused biomeditsiinilistes uuringutes. CENIC Magazine. Bioloogilised teadused, 38(2), 132-135.
  5. Wiltgen, M., & Tilz, G. P. (2007). DNA microarray analüüs: põhimõtted ja kliiniline mõju. Hematoloogia, 12(4), 271-287.