Endonukleaaside funktsioonid ja tüübid



The endonukleaase on ensüümid, mis lõikavad nukleotiidahelas paiknevaid fosfodiestersidemeid. Endonukleaaside restriktsioonisaidid on väga erinevad. Mõned neist ensüümidest lõikavad DNA-d (deoksüribonukleiinhapet, meie geneetilist materjali) peaaegu kõikjal, st nad on mittespetsiifilised.

Seevastu on veel üks rühm endonukleaase, mis on väga spetsiifilised piirkonnas või järjestuses, mida nad aktsiisiks kavatsevad. Seda ensüümide rühma tuntakse restriktsiooniensüümidena ja nad on molekulaarbioloogias väga kasulikud. Selles grupis on teadaolevad ensüümid BamHI, Eco RI ja Alu I.

Vastupidiselt endonukleaasidele on olemas ka teist tüüpi katalüütilised valgud - eksonukleaadid -, mis vastutavad fosfodiestri lüli katkestamise eest ahela lõpus.

Indeks

  • 1 Piirangute endonukleaasid
  • 2 Piirangute endonuklite funktsioonid ja rakendused
    • 2.1. Restriktiivse fragmendi pikkuse polümorfism (RFLP)
  • 3 Restruktureerivate endonukleaaside tüübid
    • 3.1 I tüüp
    • 3.2 Tüüp II
    • 3.3 III tüüp
    • 3.4 IV tüüp
  • 4 Viited

Piirangute endonukleaadid

Restriktiivsed endonukleaasid või restriktsiooniensüümid on katalüütilised valgud, mis vastutavad fosfodiestri sidemete lõhustumise eest DNA ahelas väga spetsiifilistes järjestustes..

Neid ensüüme saab omandada mitmetes biotehnoloogia ettevõtetes ja nende kasutamine on praeguste DNA manipulatsioonitehnikate raames peaaegu asendamatu.

Restruktureerimise endonukleaasid nimetatakse organismi binomilise teadusliku nimetuse esimestest tähtedest, millest nad tulevad, millele järgneb tüvi (see on valikuline) ja lõpeb restriktsiooniensüümide rühmaga, millesse nad kuuluvad. Näiteks BamHI ja Eco RI on laialdaselt kasutatavad endonukleaadid.

DNA piirkonda, mida ensüüm tuvastab, nimetatakse restriktsioonisaitiks ja see on iga endonukleaasi jaoks unikaalne, kuigi restriktsioonisaitidel võib kokku langeda mitu ensüümi. See sait koosneb tavaliselt lühikesest palindroomsest järjestusest, mis on umbes 4 kuni 6 aluspaari pikkune, nagu AGCT (Alu I jaoks) ja GAATTC EcoRI jaoks.

Palindroomsed järjestused on järjestused, mis on küll 5 'kuni 3' või 3 'kuni 5' suunas, kuid on identsed. Näiteks EcoRI puhul on palindroomne järjestus: GAATTC ja CTTAAG.

Piirangute endonuklite funktsioonid ja rakendused

Õnneks on molekulaarbioloogide jaoks bakterid arenenud evolutsioonil rida restriktsiooniendonukleaase, mis fragmenteerivad geneetilist materjali..

Looduses on need ensüümid arenenud - arvatavasti - bakterite kaitse süsteemina võõr-DNA molekulide, näiteks faagide sissetungi vastu..

Oma ja võõra geneetilise materjali eristamiseks võivad need restriktsiooniendonukleaasid tunnustada spetsiifilisi nukleotiidjärjestusi. Seega võib DNA, millel ei ole seda järjestust, bakteri sees häirimata.

Vastupidiselt sellele, kui endonukleaas tuvastab restriktsioonisaiti, seondub see DNA-ga ja lõikab selle.

Bioloogid on huvitatud elusolendite geneetilise materjali uurimisest. Kuid DNA koosneb mitmest miljonist aluspaarist. Need molekulid on äärmiselt pikad ja neid tuleks analüüsida väikestes fragmentides.

Selle eesmärgi saavutamiseks integreeritakse restriktsiooni endonukleaadid erinevatesse molekulaarbioloogia protokollidesse. Näiteks saab üksiku geeni püüda ja paljundada edasiseks analüüsiks. Seda protsessi nimetatakse geeni "kloonimiseks".

Restriktsiooni fragmendi pikkuse polümorfism (RFLP)

Restriktsioonifragmentide pikkuse polümorfismid viitavad DNA spetsiifiliste nukleotiidjärjestuste musterile, mida restriktsiooni endonukleaadid suudavad ära tunda ja lõigata.

Tänu ensüümide spetsiifilisusele iseloomustab iga organismi spetsiifilist lõigatud mustrit DNA-s, mis on erineva pikkusega pärinev fragment.

Restruktureerivate endonukleaaside tüübid

Ajalooliselt on restriktsiooni endonukleaasid klassifitseeritud kolme tüüpi ensüümidesse, mis on tähistatud rooma numbriga. Viimasel ajal on kirjeldatud neljandat tüüpi endonukleaasi.

I tüüp

I tüübi endonukleaaside kõige olulisem omadus on see, et need on valgud, mille moodustavad mitmed subühikud. Kõik need funktsioonid toimivad ühe valgu kompleksina ja tavaliselt on neil kaks alaühikut, mida nimetatakse R-ks, kaks M ja üks S.

S-osa vastutab DNA-s oleva restriktsioonisaidi tuvastamise eest. Teisest küljest on R-alaühik lõhustamiseks oluline ja M on vastutav metüülimisreaktsiooni katalüüsimise eest..

I tüübi ensüümide allkategooriaid on neli, mida tuntakse tähtedega A, B, C ja D, mis on üldkasutatavad. See klassifikatsioon põhineb geneetilisel täiendamisel.

I tüüpi ensüümid olid esimesed restriktsiooniobjektid, mis avastati ja puhastati. Kuid molekulaarbioloogias on kõige kasulikumad need II tüüpi, mida kirjeldatakse järgmises osas.

II tüüp

II tüüpi restriktsiooni endonukleaasid tunnevad ära spetsiifilised DNA järjestused ja teostavad lõhustumist konstantses asendis järjestuse lähedal, mis toodab 5 'fosfaate ja 3' hüdroksüüle. Magnetioonid on tavaliselt vajalikud kofaktoritena (Mg2+), kuid mõned neist on palju spetsiifilisemad.

Struktuuriliselt võivad need esineda monomeeridena, dimeeridena või isegi tetrameeridena. Rekombinantne tehnoloogia kasutab II tüüpi endonukleaase ja seetõttu on iseloomustatud enam kui 3500 ensüümi.

III tüüp

Need ensüümsüsteemid koosnevad kahest geenist, mida nimetatakse mod ja res, mis kodeerivad DNA-d ära tundvaid alaühikuid ja muudatusi või piiranguid. Mõlemad allüksused on piirangu jaoks vajalikud, protsess on täielikult sõltuv ATP hüdrolüüsist.

DNA molekuli lõhustamiseks peab ensüüm interakteeruma mitte-palindroomse äratundmisjärjestuse kahe koopiaga ja saidid peavad olema substraadile vastupidises suunas. Lõhustamisele eelneb DNA translokatsioon.

IV tüüp

Täiendav rühm on hiljuti tuvastatud. Süsteem koosneb kahest või enamast geenist, mis kodeerivad valke, mis lõikavad ainult modifitseeritud DNA järjestusi, olgu see siis metüülitud, hüdroksümetüülitud või hüdrosüülitud glükosüül..

Näiteks, ensüüm EckKMcrBC tuvastab kaks dinukleotiidi, mille üldvorm on RmC; puriin, millele järgneb metüülitud tsütosiin, mida saab eraldada mitme aluspaariga - 40 kuni peaaegu 3000. Lõhustumine toimub umbes 30 aluspaari järel pärast seda, kui ensüüm tuvastab.

Viited

  1. Burrell, M. M. (toim.). (1993). Molekulaarbioloogia ensüümid. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E. A., & Wilson, G. G. (2013). I tüüpi restriktsiooniensüümid ja nende sugulased. Nukleiinhapete uuringud, 42(1), 20-44.
  3. Murray, P.R., Rosenthal, K.S., & Pfaller, M.A. (2017). Meditsiiniline mikrobioloogia + StudentConsult hispaania keeles + StudentConsult. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktiivsed endonukleaadid DNA molekulide analüüsimisel ja restruktureerimisel. Biokeemia iga-aastane ülevaade, 44(1), 273-293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). II tüüpi restriktsiooni endonukleaasid: struktuur ja mehhanism. Rakulised ja molekulaarsed bioteadused, 62(6), 685.