Bakterite määrdumise omadused ja valmistamine



The bakteriaalne määrdumine kujutab endast bakteriaalsete mikroorganismide suspensiooni õhukese kile laiendust, mis viiakse läbi läbipaistva klaasplaadiga või slaididega, vaatlemiseks optilise mikroskoobi all..

Kile laiendamine toimub mikroorganismide eraldamiseks nii palju kui võimalik, sest kui nad on rühmitatud, ei ole vaatlus selge.

Bakterikultuuride uurimisel kasutatakse nende analüüsimiseks paremini määrdumise ettevalmistust, fikseerimist ja värvimist. Mikroorganismide väikese suuruse tõttu on selle vaatlemiseks vajalik optilise mikroskoobi kasutamine.

Optilised mikroskoobid on määrdeainete jälgimiseks hädavajalikud vahendid. Need kasutavad optilisi läätse ja valgust, mis võimaldab näidiste visualiseerimist suure suurusega.

Üldiselt ei ole elusrakkudel struktuure, mis on enamasti värvilised, läbi optilise mikroskoobi, need on värvitu, läbipaistev proov ja neil on väga väike sisemine kontrastsus ja ümbrus.

Vaatlus lihtsa valgusvälja mikroskoobiga, ilma lisavärvimistehnikateta, on väga piiratud ja seda kasutatakse ainult mõnel juhul, nagu mikroorganismide liikumise jälgimisel.

Mikroorganismide optimaalseks jälgimiseks tuleb saavutada tasakaal kontrastsuse ja resolutsiooni vahel. Rakkude detaile ei saa mikroskoobi all jälgida isegi suure eraldusvõimega; värvainete kasutamine on vajalik värvimistehnikate abil, mis annavad vaatluse kontrastsuse.

Indeks

  • 1 Kvaliteetse bakteriaalse määrdeaine omadused
    • 1.1 Suurepärane kontrastsus
    • 1.2 Hea kinnitus
    • 1.3 Hea värvimine
  • 2 Valmistamine
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Fikseerimine
    • 2.3 C. Lihtne värvimine
    • 2.4 D. Määrdeaine lõplik säilitamine
  • 3 Viited

Kvaliteetse bakteriaalse määrdumise omadused

Suurepärane kontrastsus

Suurepärase kontrastsuse saavutamiseks kutsutakse välja keerukaid mikroskoobi faasikontrastmikroskoop, diferentsiaalne interferents ja tume väli mikroskoop. Seda tüüpi mikroskoopi kasutatakse muuhulgas bakterite, näiteks mantlite ja kiudude jälgimiseks.

Värvimine on lihtne tehnika selge kontrastmikroskoobiga saavutatava kontrastsuse suurendamiseks. Selles meetodis võib kasutada erinevaid värvaineid, mis märgatavalt parandavad mikroskoobi all tehtud vaatlust.

Eelnevalt kuivatatud ja fikseeritud slaididel on plekid tehtud otse mikroorganismide suspensioonide määrdel või pikendusel..

Hea parandus

Fikseerimine on meetod, mida kasutatakse rakustruktuuride säilitamiseks; põhjustab mikroorganismide inaktiveerimist ja kleepumist klaasi klaasile. Seal on erinevad fikseerimisprotseduurid: soojuse fikseerimine ja keemiline fikseerimine.

Soojuse fikseerimine

See on meetod, mida kõige sagedamini kasutatakse bakteriaalse määrdumise jälgimiseks. Meetod seisneb määrdeaine bakterisuspensiooni ülekandmises kergema leegi abil. See meetod suudab säilitada bakterite välise morfoloogia, kuid hävitab nende sisemised struktuurid.

Keemiline fikseerimine

Keemiline fikseerimine kasutab kemikaale, näiteks formaldehüüdi või formaldehüüdi, etanooli ja äädikhapet. Keemiliste fikseerivate ainete kasutamise eeliseks on see, et saavutatakse mikroorganismide sisemiste rakustruktuuride säilitamine.

Hea värvimine

Kõige tavalisemad protseduurid eelnevalt kuivatatud ja fikseeritud määrdumise värvimiseks on positiivne või lihtne värvimine, diferentsiaalne värvimine ja negatiivne värvimine. On olemas ka spetsiaalseid meetodeid teatud rakustruktuuride värvimiseks (kapsel, spoor, flagella).

Positiivne värvimine või lihtne värvimine

Positiivne või lihtne värvimine on kõige sagedamini kasutatav plekieemaldustehnika. Kasutab värvaineid, mis on võimelised seonduma teatud mikroobistruktuuridega, võimaldades neid jälgida mikroskoobi all.

Nendel värvainetel on keemilises struktuuris kromofoorsed rühmad (värviline osa), millel on vahelduvad kaksiksidemed ja lihtsad sidemed (konjugatsioon). Need sidemed võivad omakorda luua ioonseid või kovalentseid sidemeid mõne rakulise struktuuriga.

Positiivses või lihtsas värvimises kasutatavad värvained on enamasti keemilised derivaadid aniliin (värvilised orgaanilised soolad).

Teisest küljest, värvide hulgas leiame mõned aluselise pH-ga ja teised happelise pH-ga.

Põhilised värvained

Põhivärvides on kromofoorirühmal positiivne elektrilaeng. Enamikul prokarüootsetest mikroorganismidest on neutraalne sisemine pH ja nende rakupind on negatiivselt laetud. Selle elektrostaatilise interaktsiooni kaudu seondub kromofoor rakuga ja värvib seda.

Baasvärvide näideteks on muuhulgas metüleensinine, violetne kristall, malahhiit roheline, põhifussiin, safraniin..

Happevärvid

Happevärvides on kromofoorirühmal negatiivne elektrilaeng. Neid kasutatakse positiivselt laetud aminorühmadega valkude värvimiseks. Happevärvide näited on happe fussiin, roos Bengal, Kongo punane ja eosiin.

Erinev värvimine

Diferentsiaalvärvimise meetod seisneb kahe erineva värvi või intensiivsusega värvi kandmises, et eristada erinevaid mikroorganisme mikroskoobi all. Gramma ja happe-alkoholi resistentsuse värvimine on kõige sagedamini kasutatavad diferentsiaalsed plekid bakterioloogias.

Gramvärvi kasutatakse esialgse testina, et teada saada lisaks rakuseina tüübile ka kuju, suurust, rakurühma. Grami värvi testi abil klassifitseeritakse rakuseinega bakterid grampositiivseteks bakteriteks ja gramnegatiivseteks bakteriteks.

Negatiivne värvimine

Selles meetodis kasutatakse keemilisi värvaineid, mis ei tungi raku sisemusse, kuid nad teevad seda, et keskkond, milles mikroorganismid on mustaks taustaks.

Negatiivse värvimise tehnikast valmistatakse mustus Hiina tindi või nigrosiini suspensiooni tilkaga, mis pärast toatemperatuuril kuivatamist lubab valguse läbipääsuks läbipaistmatu kile. Sel viisil täheldatakse mikroorganisme heledate vormidena tumedal taustal.

Ettevalmistus

A. Kärpimine

1.- Peske slaidid väga hästi, kuivatage absorbendiga ja märgistage need. Märgisel peab olema märgitud valmistise sisu, kuupäev ja selle töötleja nimi.

2.- Süüta kergem ja steriliseerige inokulatsiooniliin leekis, kuni see on punane.

3.- Laske käepide jahtuda.

4.- Võtke bakterikultuuri tuub, eemaldage kork ja liigutage kiiresti tuubi suu kergema leegi lähedale (leek).

5.- Tutvustage inokulatsiooniliini bakterikultuuri sisaldavas tuubis ja proov võetakse.

6.- Kui kultuur on vedelas keskkonnas, asetage proov, mis on võetud käepidemega slaidi keskele, ja asetage see ettevaatlikult ringi, mille läbimõõt on umbes 2 cm..

7.- Inokuleerimissilmuse steriliseerimine.

8.- Laske määrdeainet kuivatada õhus.

9.- Korrake samme 3 kuni 8 kolm korda.

10.- Kui kultuur on tahkes keskkonnas, tuleb eelnevalt slaidile asetada tilk destilleeritud vett. Seda tehakse väikese proovi segamiseks inokuleerimise käepidemega, vastavalt etappide 2 kuni 5 näidetele (aseptika tingimused)..

11.- Laiendage lahjendatud proovi slaidil olevale veepiirile ja korrake seda kolm korda.

B. Fikseerimine

1.- Kuivale määrdele lisatakse - vedelas keskkonnas kasvatatud kultuuridest - kaks tilka metanooli või absoluutset etanooli..

2.- Laske õhku kuivada kergemini.

3.- Kui määrdeaine pärineb kultuuridest tahkes keskkonnas, fikseeritakse kuiva määrdeainega kuumus, läbides selle 2 kuni 3 korda kiiremini läbi kergema leeki ala.

4.- Puudutage vasaku käe seljaosaga mustri alumist osa (parempoolse käega, muidu kasutage paremat kätt) ja kontrollige, kas see on külm.

C. Lihtne värvimine

1.- Lisage 2 tilka valitud värvainet ja laske tal toimida iga värvi spetsiifilistes protokollides nõutud aja jooksul (tavaliselt 1 kuni 5 minutit).

2.- Mõned värvid nõuavad nende aktiveerimiseks soojuse kasutamist, sel juhul on vajalik, et slaidi kuumutamisel kerise leegis oleks väga ettevaatlik (manipuleerige pintsettidega ja vältige keetmist). Maitse ülekuumenemine võib hävitada rakud, mida soovite jälgida.

3.- Eemaldage liigne värvus, pestes destilleeritud veega. Eemaldage pesuvesi, koputades selle serva ettevaatlikult slaidi, kallutades töölauda.

4.- Lasta õhu kuivatamine.

5.- Sõltuvalt vaatluse tüübist kasutatakse selles etapis katteplaati. Katteplaat kaitseb ja säilitab määret. Kui sellel etapil tehakse õli kastmisega vaatlus, ei kasutata kattekihti, kuid määret ei saa säilitada.

D. Määrdeaine lõplik säilitamine

1.- Kastke määrdeained järjestikku igasse alltoodud lahusesse vähemalt 5 minutiks. Nende "vannide" eesmärk on jätta määrdeain täielikult dehüdreeritud. Enne reaktiivi lisamist järgmisesse vannisse tuleb iga reaktiivi tühjendada.

Dehüdreerivate vannide järjekord on järgmine:

  1. Etanool 70%
  2. 95% etanooli
  3. Puhas atsetoon
  4. Segage atsetoon-ksülool 1: 1
  5. Xilol

Seejärel laske õhul kuivatada.

2.- Paigaldage katteplaat, eelistatavalt 22 × 22 mm, kasutades Kanada palsamit või muid kokkupanekumeetodeid.

Viited

  1. Briggs, G. (1965). Mikrobioloogiliste laboratoorsete õnnetuste ja nakkuste põhjuslikud tegurid. USA armee bioloogilised laborid. Fort Detrick.
  2. Cappucino, J.G. ja Welch, C.T. (2017). Mikrobioloogia: labori käsiraamat. Pearson.
  3. Holt, J.G. Toimetaja (1977). Lühem Bergey määrav bakterioloogia käsiraamat. 8th Baltimore: The Williams ja Wilkins Co.
  4. Johnson, T.R. ja kohtuasi; C.L. (2018). Laboratoorsed katsed mikrobioloogias. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostiline mikrobioloogia. 14th St. Louis, USA: Elsiever, Inc.