Piiranguensüümide funktsioonid, toimemehhanism, liigid ja näited



The restriktsiooniensüümid need on endonukleaadid, mida teatud arhiivid ja bakterid kasutavad viiruste leviku inhibeerimiseks või piiramiseks nende sees. Need on eriti levinud bakterites ja on osa nende kaitsesüsteemist võõr-DNA suhtes, mida tuntakse piirangu- / modifitseerimissüsteemina.

Need ensüümid katalüüsivad kaheahelalise DNA lõikamist teatud kohtades, reprodutseeritavalt ja ilma täiendava energia kasutamiseta. Enamik neist nõuavad kofaktorite nagu magneesium või teised kahevalentsed katioonid, kuigi mõned nõuavad ka ATP või S-adenosüülmetioniini..

Piirangute endonukleaase avastasid 1978. aastal Daniel Nathans, Arber Werner ja Hamilton Smith, kes said Nobeli meditsiinipreemia nende avastamise eest. Selle nimi tuleneb tavaliselt organismist, kus neid esimest korda täheldatakse.

Selliseid ensüüme kasutatakse laialdaselt DNA kloonimismeetodite ja teiste molekulaarbioloogia ja geenitehnoloogia strateegiate väljatöötamisel. Selle tunnused spetsiifiliste järjestuste tuvastamisel ja võime lõigata tuvastuskohtade lähedusse jäävad järjestused muudavad need võimekaks geneetilise eksperimenteerimise vahendiks.

Fragmente, mis on genereeritud restriktsiooniensüümide poolt, mis on toiminud konkreetsele DNA molekulile, saab kasutada esialgse molekuli "kaardi" taastamiseks, kasutades informatsiooni saitide kohta, kus ensüüm DNA-d lõigas.

Mõnedel restriktsiooniensüümidel võib DNA-s olla sama tuvastamiskoht, kuid nad ei pruugi seda samal viisil lõigata. Seega on olemas ensüüme, mis teevad kärpeid, jättes nüriid otsi ja ensüüme, mis lõikavad lahkuvate otsade, millel on erinevad molekulaarbioloogia rakendused..

Praegu on sadu erinevaid kaubanduslikult kättesaadavaid restriktsiooniensüüme, mida pakuvad erinevad kommertsmajad; need ensüümid töötavad nagu "kohandatud" molekulaar käärid erinevatel eesmärkidel.

Indeks

  • 1 Funktsioonid
  • 2 Toimemehhanism
  • 3 tüüpi
    • 3.1 I tüüpi restriktsiooniensüümid
    • 3.2 II tüüpi restriktsiooniensüümid
    • 3.3 III tüüpi restriktsiooniensüümid
    • 3.4 IV tüüpi restriktsiooniensüümid
    • 3.5 V tüüpi restriktsiooniensüümid
  • 4 Näited
  • 5 Viited

Funktsioonid

Restriktsiooniensüümid teenivad polümeraaside vastupidist funktsiooni, kuna nad hüdrolüüsivad või lõhustavad nukleotiidahelas asuvate külgnevate nukleotiidide vahelise fosfodiestri sideme estri sideme.

Molekulaarbioloogias ja geenitehnoloogias kasutatakse neid laialdaselt ekspressiooni- ja kloonimisvektorite konstrueerimiseks ning spetsiifiliste järjestuste identifitseerimiseks. Samuti on need kasulikud rekombinantsete genoomide konstrueerimiseks ja neil on suur biotehnoloogiline potentsiaal.

Hiljutised geeniteraapia edusammud võimaldavad praeguste restriktsiooniensüümide kasutamist teatud geenide sisseviimiseks vektoritesse, mis on selliste geenide transportimiseks elusrakkudesse, ja mis tõenäoliselt on võimelised sisestama raku genoomi, et seda teha püsivad muutused.

Toimemehhanism

Restriktsiooniensüümid võivad katalüüsida kaheahelalise DNA lõikamist, kuigi mõned on võimelised tuvastama üheahelalisi DNA järjestusi ja isegi RNA-d. Lõikamine toimub pärast järjestuste äratundmist.

Toimemehhanism seisneb fosfodiestri sideme hüdrolüüsil fosfaadirühma ja deoksüriboosi vahel iga DNA ahela selgroog. Paljud ensüümid on võimelised lõigama samasse kohta, mida nad tunnevad, samas kui teised lõigavad 5 või 9 paari baari enne või pärast seda..

Tavaliselt lõigatakse need ensüümid fosfaatrühma 5'-otsas, tekitades DNA fragmendid 5 'fosforüülotsaga ja terminaalse 3' hüdroksüülotsaga.

Kuna valgud ei puutu otseselt DNA tuvastuskohaga, tuleb need järjestikku ümber paigutada, kuni nad jõuavad konkreetsesse kohta, võib-olla DNA ahelas olevate "libisevate" mehhanismide abil..

Ensümaatilise lõikamise ajal paikneb iga DNA ahela fosfodiestri sidumine restriktsiooniensüümide ühe aktiivse kohta. Kui ensüüm lahkub tunnustus- ja lõikamiskohast, teeb see seda mittespetsiifiliste siirdeühenduste kaudu.

Tüübid

Praegu on teada viis tüüpi restriktsiooniensüüme. Allpool on iga lühike kirjeldus:

I tüüpi restriktsiooniensüümid

Need ensüümid on suured pentameersed valgud, millel on kolm subühikut, piirang, metüülimine ja teine ​​DNA järjestuste tuvastamiseks. Need endonukleaasid on multifunktsionaalsed valgud, mis on võimelised katalüseerima restriktsiooni- ja modifitseerimisreaktsioone, neil on ATPaasi aktiivsus ja ka DNA topoisomeraas..

Seda tüüpi ensüümid olid esimesed avastatavad endonukleaasid, neid puhastati esimest korda 1960. aastatel ja sellest ajast alates on neid uuritud põhjalikult.

I tüüpi ensüüme biotehnoloogilise vahendina ei kasutata laialdaselt, kuna lõikamiskoht võib olla tuvastuskohast erineva kaugusega kuni 1000 baaspaari, mis muudab need katsete reprodutseeritavuse seisukohast ebausaldusväärseks..

II tüüpi restriktsiooniensüümid

Need on ensüümid, mis koosnevad homodimeeridest või tetrameeridest, mis lõikavad DNA-d kindlaksmääratud kohtades vahemikus 4 kuni 8 bp. Need lõikepunktid on tavaliselt palindroomsed, st nad tunnevad ära järjestused, mis on mõlemas suunas samal viisil loetavad.

Paljud bakterites esinevad II tüüpi restriktsiooniensüümid vähendavad DNA-d, kui nad tunnevad ära nende võõra iseloomu, kuna neil ei ole oma DNA tüüpilisi modifikatsioone..

Need on kõige lihtsamad restriktsiooniensüümid, kuna nad ei vaja DNA järjestuste äratundmiseks ja lõikamiseks muud kofaktorit kui magneesiumi (Mg +)..

II tüüpi restriktsiooniensüümide täpsus lihtsate järjestuste tuvastamisel ja lõikamisel DNA-s täpsetes positsioonides muudab need üheks kõige enam kasutatavaks ja asendamatuks enamikus molekulaarbioloogia valdkondades..

II tüüpi restriktsiooniensüümide grupis on mitmed alamklassid, mis on klassifitseeritud vastavalt teatud omadustele, mis on igaühele ainulaadsed. Nende ensüümide klassifitseerimine toimub tähestiku tähtede lisamisega A-st Z-le, järgides ensüümi nime.

Mõned alamklassid, mis kõige tuntumad on nende kasulikkuse poolest, on järgmised:

Alamklass IIA

Nad on erinevate allüksuste dimeerid. Nad tunnevad asümmeetrilisi järjestusi ja neid kasutatakse ideaalsete lähteainetena lõikamisensüümide genereerimiseks.

Alamklass IIB

Need koosnevad veel ühest dimeerist ja lõigatakse DNA mõlemal pool tuvastamisjärjestust. Nad lõigavad mõlemad DNA ahelad erinevates aluspaarides väljaspool tuvastuskohta.

Alamklass IIC

Seda tüüpi ensüümid on polüpeptiidid, millel on DNA ahelate jagamise ja modifitseerimise funktsioonid. Need ensüümid lõigavad mõlemad ahelad asümmeetriliselt.

Alamklass IIE

Selle alaklassi ensüümid on geenitehnoloogias kõige enam kasutatavad. Neil on katalüütiline koht ja nad vajavad üldiselt allosteerilist efektorit. Efektiivse lõikamise tegemiseks peavad need ensüümid suhtlema oma äratundmisjärjestuse kahe koopiaga. Selles alaklassis on ensüümid EcoRII ja EcoRI.

III tüüpi restriktsiooniensüümid

III tüübi restriktsiooni endonukleaadid koosnevad ainult kahest allüksusest, üks vastutab DNA äratundmise ja modifitseerimise eest, teine ​​vastutab järjestuse lõikamise eest..

Need ensüümid vajavad nende toimimiseks kahte kofaktorit: ATP ja magneesium. Sellist tüüpi restriktsiooniensüümidel on kaks asümmeetrilist äratundmissaiti, DNA ümber paigutatakse ATP-sõltuval viisil ja lõigatakse see 20 kuni 30 bp kaugusele tuvastuskoha läheduses..

IV tüüpi restriktsiooniensüümid

IV tüübi ensüümid on kergesti identifitseeritavad, kuna nad lõikavad DNA-d metüülimismärgistega, nad koosnevad mitmest erinevast allüksusest, mis vastutavad DNA järjestuse äratundmise ja lõikamise eest. Need ensüümid kasutavad kofaktoritena GTP ja kahevalentset magneesiumi.

Spetsiifilised lõikamiskohad hõlmavad nukleotiidahelaid, milles on metüülitud või hüdroksümetüülitud tsütosiini jääke ühes või mõlemas nukleiinhapete ahelas.

V tüüpi restriktsiooniensüümid

Sellesse klassifitseeritakse CRISPER-Cas tüüpi ensüümid, mis identifitseerivad ja lõikavad spetsiifilisi DNA järjestusi sissetungivatelt organismidelt. Cas-ensüümid kasutavad sissetungivate organismide tuvastamiseks ja rünnamiseks CRISPERi sünteesitud juht RNA ahelat.

V-tüüpi klassifitseeritud ensüümid on polüpeptiidid, mis on struktureeritud I, II ja II tüüpi ensüümide järgi. Nad võivad lõigata peaaegu iga organismi DNA-d ja suurte pikkustega. Nende paindlikkus ja kasutusmugavus teevad need ensüümid tänapäeval II tüübi ensüümidega üheks geenitehnoloogia kõige sagedamini kasutatavateks vahenditeks..

Näited

DNA polümorfismide avastamiseks on kasutatud restriktsiooniensüüme, eriti populatsioonigeneetika uuringutes ja mitokondriaalset DNA-d kasutavates evolutsioonilistes uuringutes, et saada informatsiooni nukleotiidide asenduste kiiruste kohta..

Praegu on erinevatel eesmärkidel kasutatavate bakterite transformeerimiseks kasutatavatel vektoritel multiklonakse saidid, kus on leitud mitmete restriktsiooniensüümide tuvastuskohad..

Nende ensüümide seas on kõige populaarsemad need, mis on esmakordselt saadud ja kirjeldatud, EcoRI, II, III, IV ja V E. coli; HindIII, alates H. influenzae ja BamHI B. amyloliquefaciens.

Viited

  1. Bickle, T. A., & Kruger, D. H. (1993). DNA piiramise bioloogia. Mikrobioloogilised ülevaated, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D. A., & Horvath, P. (2007). CRISPR pakub omandatud resistentsust viiruste vastu prokarüootides. Teadus, 315(Märts), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekulaarne perspektiiv: Restriction Endonucleases. Tüvirakkude vähktõve põhialused, 20, 190-191.
  4. Halford, S.E. (2001). Hüppamine, hüppamine ja silmus restriktsiooniensüümidega. Biokeemilise ühiskonna tehingud, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Liikide identiteedi säilitamine ja bakterite spekulatsiooni kontroll: uus funktsioon piirangute / modifitseerimise süsteemide jaoks? Geen, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewini geenid XII (12 ed.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). I ja III tüübi CRISPR-Cas süsteemide kasutamine genoomide redigeerimiseks. Nukleiinhapete uuringud, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E. A., & Wilson, G.G. (2013). I tüüpi restriktsiooniensüümid ja nende sugulased. Nukleiinhapete uuringud, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Endonukleaaside restriktsioon DNA molekulide analüüsimisel ja restruktureerimisel. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., ja Tajima, F. (1981). Dna polümorfism, mis on tuvastatav restriktsiooni endonukleaasidega. Geneetika, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Rakuline ja molekulaarne eluteadus II tüüpi restriktsiooni endonukleaasid: struktuur ja mehhanism. CMLS Cellular ja Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Kuidas restriktsiooniensüümid muutusid molekulaarbioloogia tööhobusteks. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J. ja Murray, K. (1976). Piirangute endonukleaadid. Kriitilised ülevaated biokeemias, (November), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Hominguv endonukleaasi struktuur ja funktsioon. Kvartaalsed ülevaated biofüüsikast, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Piirangute ja piirangute vastane bioloogia. Praegune arvamus mikrobioloogias, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., ja Murray, N. E. (1991). Piiramise ja modifitseerimise süsteemid. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Genoomne arusaam Campylobacter jejuni virulentsusest ja populatsiooni geneetikast. Nakatada Dis. Tõlge. Med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Multifunktsionaalsete piirangute endonukleaaside struktuur ja mehhanism. Annu. Biochem., 50, 285-315.